熒光素的搭配，是多色體系搭建的第一步，要兼顧抗原表達豐度與熒光亮度。細胞表面標志物表達水平各有不同，部分標志物屬于高豐度表達，部分屬于低豐度表達。低豐度的靶標，如果搭配亮度偏弱的熒光素，陽性群體信號容易淹沒在背景噪聲之中；高豐度靶標搭配過強熒光，又容易出現(xiàn)信號溢出，干擾相鄰通道。在設計之初，可以把低表達靶標分配亮度更高的熒光素，高表達靶標分配中等亮度熒光素。同時要留意串聯(lián)型熒光染料，這類染料對于固定、光照較為敏感，如果實驗流程包含后續(xù)固定步驟，就要評估這類染料是否適配整套流程，避免染色之后信號出現(xiàn)衰減。

　　表位特性與實驗處理流程之間的匹配，很容易被忽略。部分抗體識別的是細胞膜外側天然構象表位，適合活細胞染色；當實驗需要做胞內或者核內染色，會經過固定、通透步驟，蛋白空間構象會發(fā)生改變，只識別天然構象的抗體就無法結合靶標，得不到有效信號。同一個靶標，不同克隆識別的表位不一樣，活細胞染色效果良好，不代表可以直接用于胞內染色。搭建panel時，需要區(qū)分本次實驗是活細胞表面染色，還是需要破膜處理的胞內檢測，確認對應抗體適配的實驗處理條件，不要直接照搬文獻當中的panel組合，文獻的樣本處理流程未必和自身實驗一致。

　　不同樣本來源，同樣會影響染色效果，外周血分離單細胞、實體組織消化制備單細胞懸液、體外培養(yǎng)細胞，三類樣本的細胞狀態(tài)有差異。實體組織經過酶消化，部分細胞膜表面蛋白會被酶降解，對應的抗原表位丟失，抗體無法結合，出現(xiàn)假陰性結果。使用組織來源單細胞懸液開展實驗，需要評估消化酶種類、消化時長會不會破壞待檢測靶標。如果文獻缺少相關參考，可設置對照，使用未經過消化處理的同源細胞，對比染色信號，以此判斷消化流程是否對靶標帶來破壞。

　　多色實驗當中熒光補償是關鍵環(huán)節(jié)，補償設置不合理，通道之間熒光溢漏會干擾分群。很多研究人員直接使用儀器預設補償，沒有結合本次panel開展對應補償管設置，不同熒光組合，溢漏情況存在差異，預設補償不能適配所有panel。每一套全新的多色組合，都要準備單染補償管，每一支補償管僅標記單一熒光，以此完成補償計算。樣本數量較多的批次實驗，細胞活力會隨時間下降，死細胞會出現(xiàn)非特異性染色，抬升整體背景，建議加入活死細胞染料，在數據分析階段把死細胞群體排除，減少死細胞帶來的干擾。

　　多色流式panel不是簡單把多款抗體混合，熒光分配、表位適配、樣本處理、補償設置共同決定實驗質量。Caprico Biotechnologies流式細胞抗體為免疫表型分析提供可選材料，完整的預實驗驗證，才可以保障細胞分群清晰，實驗結果具備可重復性。